Выявление днк возбудителя коклюша

Определение ДНК возбудителей коклюша и бронхосептикоза в соскобе эпителиальных клеток слизистой носоглотки и/или ротоглотки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени.

Коклюш – это острая воздушно-капельная инфекция, вызываемая микроорганизмами вида Bordetella pertussis, характеризуемая поражением слизистой оболочки преимущественно гортани, трахеи, бронхов и развитием судорожного приступообразного кашля. 

Коклюш относят к детским инфекциям, однако в возрастной структуре в последние годы преобладают подростки и взрослые, которые в большинстве случаев переносят коклюш в атипичной форме. У грудных невакцинированных детей коклюш протекает очень тяжело и представляет прямую угрозу для жизни. 

Входными воротами инфекции служит слизистая оболочка респираторного тракта. Палочки коклюша проявляют строгий тропизм к клеткам мерцательного эпителия, прикрепляются к ним и размножаются на поверхности слизистой оболочки, не проникая в кровоток. Размножение обычно происходит на протяжении 2-3 недель и сопровождается выделением ряда сильных экзотоксинов, основными из них являются КТ (коклюшный токсин) и аденилатциклаза, которые способствуют развитию патологического процесса (воспаление, увеличение секреции слизи, появление изъязвлений эпителия дыхательных путей, очаговый некроз). 

Коклюш относится к числу заболеваний с циклическим течением. Выделяют четыре последовательных периода: инкубационный, продолжительность которого составляет 3-14 дней (в среднем 7-8 дней); катаральный, или предсудорожный (10-13 дней); судорожный, или спазматический (1-1,5 недели у иммунизированных детей и до 4-6 недель у непривитых), период реконвалесценции (ранний – развивающийся через 2-8 недель от начала клинических проявлений и поздний – спустя 2-6 месяцев). 

Заболевание продолжается минимум две недели без явлений интоксикации и повышения температуры тела, протекает с приступообразным кашлем, усиливающимся ночью и по утрам. Кашель сопровождается покраснением лица, шумными вдохами (репризами), которые заканчиваются отхождением вязкой слизи или рвотой в конце приступа. 

Bordetella bronchiseptica – возбудитель бронхосептикоза – поражает главным образом домашних животных, а также людей, инфицирующихся при контакте с больными животными. Бронхосептикоз у людей протекает в виде ОРЗ с приступами сухого кашля, особенно перед сном. 

Лабораторная диагностика коклюша и коклюшеподобных заболеваний приобретает особую значимость в связи с трудностью клинического распознавания и в настоящее время является важным звеном в системе противоэпидемических мероприятий. 

Бактериологический метод является «золотым стандартом» лабораторной диагностики, позволяет выделить культуру возбудителя на питательной среде и идентифицировать возбудителя до вида. Но успешен он только в ранние сроки заболевания – первые 2 недели.

Серодиагностика (выявление противококлюшных антител) может быть применена на более поздних сроках, начиная со 2-й недели заболевания. При наличии типичных клинических проявлений она позволяет лишь подтвердить диагноз, в то время как при стертых и атипичных формах серодиагностика может оказаться решающей в выявлении заболевания. 

ПЦР является высокочувствительным, специфичным и быстрым методом, который может быть использован в разные сроки заболевания даже на фоне приема антибиотиков при выявлении атипичных и стертых форм коклюша. Наличие в анамнезе вакцинации против коклюша не влияет на результаты ПЦР.

Литература

1. МР 3.1.2.0072-13. Диагностика коклюша и паракоклюша. https://www.rospotrebnadzor.ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=4676 
2. Николаева И.В., Шайхиева Г.С. Коклюш на современном этапе. Вестник современной клинической медицины. 2016;9(2):25-29. DOI: 10.20969/VSKM. 2016;9(2):25-29. https://cyberleninka.ru/article/n/koklyush-na-sovremennom-etape/viewer 
3. Прадед М.Н., Яцышина С.Б., Селезнева Т.С., Малинина С.В., Бирюлева Н.В., Любимова Т.Е., Воробьева Н.С. ПЦР-диагностика инфекций, вызванных B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica. Клиническая лабораторная диагностика. 2013;(1):53-56. https://cyberleninka.ru/article/n/ptsr-diagnostika-infektsiy-vyzvannyh-b-pertussis-b-parapertussis-i-b-bronchiseptica/viewer 
4. Тюкавкина С.Ю., Харсеева Г.Г. Коклюш: эпидемиология, биологические свойства Bordetella pertussis, принципы лабораторной диагностики и специфической профилактики. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014;19(4):50-60. https://cyberleninka.ru/article/n/koklyush-epidemiologiya-biologicheskie-svoystva-bordetella-pertussis-printsipy-laboratornoy-diagnostiki-i-spetsificheskoy/viewer

Bordetella pertussis, ДНК [ПЦР]

Общая информация об исследовании

Bordetella pertussis (B. pertussis) – это грамотрицательная аэробная коккобацилла, являющаяся возбудителем коклюша. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Риск заболеть наиболее высок у не вакцинированных АКДС детей и беременных женщин. Следует отметить, что прививка АКДС не обеспечивает стопроцентную защиту от заражения, так как иммунный ответ постепенно угасает в течение 1-3 лет после вакцинации. В этой связи подростки и взрослые, вакцинированные более чем 3 года назад и находившиеся в тесном контакте с больным коклюшом или носителем B. pertussis, также подвергаются риску заражения.

В клинической практике применяют несколько лабораторных тестов для диагностики коклюша: посев на питательную среду, метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), серологические методы и исследование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР – метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в носоглоточном аспирате) фрагменты генетического материала (ДНК) возбудителя инфекции и наиболее точно и быстро диагностировать коклюш.

Специфичность ПЦР достигает 100 %, что обусловлено использованием в реакции специфичной именно для B. pertussis пары праймеров. Положительный результат у пациента с признаками поражения респираторного тракта позволяет подтвердить диагноз «коклюш» и исключить наличие других бактериальных (в том числе паракоклюша) и вирусных заболеваний.

Исследование с помощью ПЦР характеризуется высокой чувствительностью, превосходящей чувствительность бактериологического метода, ПИФ и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Следует, однако, заметить, что она зависит от клинической стадии заболевания, в которую был взят биоматериал, от возраста пациента и предшествующего лечения.

В течении коклюша можно выделить 4 стадии: инкубационный период, катаральную, пароксизмальную стадию и стадию выздоровления. ПЦР является предпочтительным методом идентификации возбудителя при подозрении на коклюш в катаральную и раннюю пароксизмальную стадию (около 4 недель после появления первых симптомов). В этот период чувствительность ПЦР максимальна и превосходит чувствительность бактериологического метода. По прошествии более 3-4 недель чувствительность ПЦР несколько снижается. Это имеет особое значение при диагностике заболевания у взрослых пациентов, которые, как правило, игнорируют первые симптомы болезни, характерные для катаральной стадии, и обращаются за помощью в более поздние сроки, в пароксизмальную стадию. При диагностике коклюша в позднюю пароксизмальную стадию и при выздоровлении наиболее точные результаты будут получены при комбинации серологических исследований (например, РНГА) и исследования с помощью ПЦР.

Также ПЦР оптимальна для диагностики коклюша у младенцев, хотя у детей старшего возраста, а также подростков и взрослых она характеризуется большим числом ложноотрицательных результатов. Так, ее чувствительность при взятии биоматериала в первые 10 дней болезни в возрастных группах до 1 года, 1-4 года и старше 5 лет составила 70, 50 и 10 % (для сравнения: чувствительность «золотого стандарта» диагностики коклюша — посева на питательную среду — в этот период не превышает 60 %). В качестве биоматериала для диагностики коклюша у младенцев предпочтителен носоглоточный аспират. У детей старшего возраста, подростков и взрослых берут мазки из носоглотки и зева. Использование тампона из кальция альгината в этом случае не рекомендуется.

В отличие от других лабораторных методов, точность ПЦР в меньшей степени зависит от приема антибактериальных препаратов. Так, чувствительность метода при взятии биоматериала на 4-й день лечения эритромицином составила 89 % (бактериологического посева – 56 %), на 7-й день – 56 % (посева – 0). Поэтому ПЦР чаще выбирают для выявления B. pertussis у пациентов в катаральной стадии заболевания, если биоматериал сдается на фоне начатого лечения. Результаты теста при сдаче биоматериала на фоне лечения в пароксизмальную стадию во многих случаях ложноотрицательные.

Исследование с помощью ПЦР с успехом применяется у вакцинированных АКДС пациентов. При этом идентификация B. pertussis в мазках этой группы может означать транзиторное носительство, но не активную инфекцию, поэтому результаты ПЦР рекомендуется оценивать с помощью дополнительных эпидемиологических, клинических и лабораторных данных.

Для чего используется исследование?

• Для диагностики коклюша, особенно у младенцев в период катаральной и ранней пароксизмальной стадии заболевания.

Когда назначается исследование?

• При симптомах коклюша в катаральной стадии: лихорадка, насморк, заложенность носа, слезотечение.
• При симптомах коклюша в пароксизмальной стадии: приступы интенсивного кашля, сопровождающиеся глубоким свистящим вдохом, рвотой, цианозом кожи лица.
• При обследовании пациента, находившегося в тесном контакте с больным коклюшем.

Возбудитель коклюша, ДНК Bordetella pertussis, ПЦР качественный — определение ДНК Bordetella pertussis, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени». 

Bordetella pertussis-возбудитель коклюша.

Коклюш — острое, антропонозное, распространённое, бактериальное, инфекционное заболевание, несмотря на повсеместную вакцинацию.

Коклюш вызывается бактерией Bordetella pertussis. Это аэробная, неподвижная, грамотрицательная бактерия. Передается заболевание воздушно-капельным путем. Заболевание чаще всего встречается у детей до 5 лет, но может поражать и взрослых, в таком случае болезнь протекает атипично.

Инкубационный период составляет 5–10 дней (иногда до 3 недель), что говорит о длительном заболевании.

Заболевание начинается постепенно. В клиническом течении коклюша выделяют три периода: катаральный, это период неотличимый от обычной простуды, период спазматического кашля и период выздоровления. Возможно развитие острых и хронических осложнений, как инфекционных, так и неинфекционных. Большинство из них развивается в период спазматического кашля, который длится от 1 до 6 недель. В это период заразность снижается, но бывают случаи, что больные продолжают выделять возбудителя в течение 3 недель от начала кашля. В характерных случаях диагноз ставят по клинической картине, у людей, не имеющих иммунитета, классические проявления коклюша трудно спутать с другим заболеванием. У иммунных лиц симптомы не столь классические.

Клинические проявления коклюша
Клинические проявления коклюша: бронхит, плеврит, гнойный отит, ложный круп, самое частое осложнение — это пневмония. Иногда наблюдаются тяжелые осложнения, которые возникают в результате сильных кашлевых толчков (кровоизлияние в мозг, разрыв барабанных перепонок, пневмоторакс и т. д.).

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) 
Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) — позволяет идентифицировать наличие в биологическом материале искомого участка генетического материала. Данный метод ныне является самым быстрым и достоверным методом диагностики инфекционных заболеваний.

В отличие от других лабораторных методов, точность ПЦР в меньшей степени зависит от приема антибактериальных препаратов. Так, чувствительность метода при взятии биоматериала на 4-й день лечения эритромицином составила 89 % (бактериологического посева — 56 %), на 7-й день — 56 % (посева — 0). Поэтому ПЦР чаще выбирают для выявления B. pertussis у пациентов в катаральной стадии заболевания, если биоматериал сдается на фоне начатого лечения.

Показания:

• подозрение на коклюш;
• эпидемиологические исследования — обследование контактировавших с больным коклюшем;
• обследование взрослых, которые работают в детских учреждениях, с подозрением на коклюш;
• при симптомах коклюша в катаральной стадии: лихорадка, насморк, заложенность носа, слезотечение;
• при симптомах коклюша в пароксизмальной стадии: приступы интенсивного кашля, сопровождающиеся глубоким свистящим вдохом, рвотой, цианозом кожи лица;
• при обследовании пациента, находившегося в тесном контакте с больным коклюшем.

Подготовка
Соскоб из носо- и ротоглотки
Сдача соскоба осуществляется спустя 2–4 часа после последнего приема пищи. За 1 час до взятия биоматериала нельзя курить, чистить зубы. В течение 6 часов перед процедурой нельзя использовать спреи для орошения, назальные капли, таблетки для рассасывания.

Перед выполнением взятия соскоба, рот необходимо прополоскать кипяченой водой. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой необходимо высморкаться.

Интерпретация результатов
Единицы измерения: тест качественный результат выдаётся в терминах «обнаружено» или «не обнаружено».

Референсные значения: отрицательно – «не обнаружено».

Причины положительного результата:

• коклюш;
• транзиторное носительство.

Причины отрицательного результата:

• отсутствие коклюша;
• неправильное взятие биоматериала на исследование;
• ложноотрицательные результаты чаще наблюдаются при сдаче биоматериала в позднюю пароксизмальную стадию и стадию реконвалесценции, на фоне лечения антибиотиками, у подростков и взрослых пациентов.

Важные замечания
Анализ не предназначен для оценки эффективности лечения.

Результат исследования следует оценивать с помощью дополнительных эпидемиологических, клинических и лабораторных данных.