Тельца пашена при оспе

№ 41 Возбудитель натуральной оспы. Таксономия. Харак­теристика. Лабораторная …

№ 41 Возбудитель натуральной оспы. Таксономия. Харак­теристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика оспы на современном этапе.
Таксономия.Вирус натуральной ос­пы — ДНК-содержащий, семейство Poxviridae, род Orthopoxvirus.
Морфология и антигенная структура. Вирионы поксвирусов имеют кирпичеобразную или овоидную форму. Вирус натуральной оспы — один из самых крупных вирусов, обнаружен в световом мик­роскопе. Вирионы видны при специальных методах окраски в виде так называемых элементарных телец Пашена (ок­раска серебрением по Морозову). Поверхность вириона состоит из нитевидных, овоидных эле­ментов. Оболочка и наружная мембрана вири­она заключают сердцевину (ДНК и белки) и мембрану сердцевины. Геном вириона — двунитевая линейная ДНК с ковалентно замкнутыми кон­цами. Вирусы имеют более 30 структурных белков. Антигены — нуклеопротеиновый, растворимые и гемагглютинин; имеются общие ан­тигены с вирусом вакцины.
Культивирование.Вирус размножается: в куриных эмбрионах с образованием белых бляшек на хорион-аллантоисной оболочке; в культуре клеток, в цитоплазме которых формируются ха­рактерные околоядерные включения.
Резистентность.Вирусы устойчивы к вы­сушиванию и низким температурам, нечувс­твительны к эфиру. Моментально погибают при 100С, а при 60С — через 15 мин.
Эпидемиология.Особо опасная конвенционная (ка­рантинная) инфекция. Источником инфек­ции является больной человек, который заразен с последних дней инкубационного периода и до отпадения корок высыпаний. Инфицирование происходит воздушно-капель­ным, воздушно-пылевым, а также контактно-бытовым путями при соприкосновении с ве­щами больного, загрязненными слизью, гноем, калом и мочой, содержащими вирус.
Патогенез. Вирус прони­кает через слизистые оболочки верхних ды­хательных путей, реже — через кожу и после размножения в регионарных лимфатических узлах попадает в кровь. Из крови возбудитель заносится в кожу и лимфоидные ткани, в которых происходит размноже­ние вирусов, формируются очаги поражения в коже, слизис­тых оболочках и паренхиматозных органах. Характерно образование папулезных высыпаний.
Клиника.Инкубационный период 7—17 дней. Заболевание проявляется высокой температурой тела, рвотой, головной и поясничной болями, появлением сыпи. Первоначально сыпь имеет вид розовых пятен, которые затем переходят сначала в узелки — папулы, а затем — в пузырьки (везикулы) и пустулы , подсыхающие и превращающиеся в корки.
Различают несколько форм оспы: тяжелую (пустулезно-геморрагическая); среднетяжелую; легкую (оспа без сыпи, оспа без повыше­ния температуры тела).
Иммунитет. После перенесенной болезни формируется стойкий пожизненный иммуни­тет, обусловленный появлением вируснейтрализующих антител, интерферонов и актива­цией факторов клеточного иммунитета.
Микробиологическая диагностика. Исследуют содержимое элементов сыпи, отделяемое носоглотки, кровь, пора­женные органы и ткани. Вирус выявляют при электронной микроскопии, в РИФ, РП, по образованию телец Гварниери. Выделяют вирус путем заражения куриных эмбрионов и культур клеток с последующей идентифика­цией в реакции нейтрализации (на куриных эмбрионах), РСК, РТГА. Серологическую диагностику проводят в РТГА, РСК, РИГА, реакции нейтрализации.
Лечение. Симптоматическое; ин­дукторами интерферона и противовирусными препаратами.
 Профилактика. Прочный им­мунитет создает живая оспенная вакцина. Ее готовят из соскобов сыпи телят или при культи­вировании вируса вакцины (осповакцины) на куриных эмбрионах. Вакцину вводят накожно. Разработана оральная таблетированная вакцина, менее реактогенная.

Источник

ирусные поражения кожи. Ветряная оспа

Вирусные поражения кожи. Ветряная оспа — опоясывающий и пузырьковый лишай

Вирусы отличаются от бактерий малыми размерами и отсутствием способности к биологическому окислению. Величина различных вирусов колеблется от пределов видимости (их можно обнаружить только в электронном микроскопе) до 0,35 u. Максимальным размером обладает вирус заразительного моллюска — его можно обнаружить при исследовании в обычном микроскопе. Вследствие неспособности к биологическому окислению вирусы могут размножаться только в живых клетках и не могут быть культивированы на обычных искусственных средах.

Некоторые вирусы могут расти на хорионаллантоисе куриного эмбриона [Гудпастер, Вудраф и Баддинг (Goodpasture, Woodruff, Buddingh)].

При гистологическом исследовании большинства вирусных заболеваний можно обнаружить особые включения, которые представляют собой колонии вирусов [Гудпастер, Вудраф и Баддинг; Блэнд и Робинов (Bland, Robinow); Эберт; Отсука (Otsuka)]. Вирусы внутри включений часто обозначаются как элементарные тельца. Последние известны под различными названиями.

Так, например, они называются тельцами Гварньери (Guarnieri) при оспе, тельцами Липшютца (Lipschutz) — при ветряной оспе, опоясывающем лишае и пузырьковом лишае, моллюсковыми тельцами — при заразительном моллюске. Так как Пашен (Paschen) первый обнаружил присутствие вируса, или элементарных телец, во включениях Гварньери при оспе, элементарные тельца при этом заболевании часто называют также тельцами Пашена.

вирусные поражения кожи

Ветряная оспа — опоясывающий и пузырьковый лишай

Эти четыре заболевания мы описываем вместе, так как строение пузырьков при них очень сходное.

При всех этих заболеваниях вирус локализуется в пузырьках. Вирусы ветряной оспы и пузырькового лишая могут быть культивированы на хорионаллантоисе куриного эмбриона, зараженного пузырной жидкостью. Получить рост вирусов оспы и опоясывающего лишая невозможно. Однако Гудпастеру и Андерсону, а также Бланку, Кориеллу и Скотту (Blank, Coriell, Scott) удалось инфицировать эпидермис человека, пересаженный на хорионаллантоис куриного эмбриона, жидкостью, полученной из пузырьков опоясывающего лишая.

Читайте также:  Как вылечить оспу у курицы

Возможно, что вирусы ветряной оспы и опоясывающего лишая идентичны. В пользу этого говорят многие клинические [Бруусгаард (Bruusgaard)] и экспериментальные [Брэйн (Brain)] данные. Уайз и Сульцбергер считают, что опоясывающий лишай представляет собой иммунную или аллергическую форму ветряной оспы, развивающуюся у больных, которые в прошлом перенесли клинические или субклинические явления ветряной оспы.

При оспе распространенные высыпания состоят вначале из узелков. Через 2—3 дня узелки становятся пузырьками с характерным пупкообразным вдавлением в центре. Через 3 дня пузырьки превращаются в пустулы. В тяжелых случаях наряду с этим могут появиться и высыпания типа пурпуры. Характерным для оспы признаком является то, что все элементы находятся в одинаковой стадии развития.

Высыпания при ветряной оспе также бывают распространенными. Вначале элементами сыпи являются маленькие узелки, вскоре превращающиеся в пузырьки. Пузырьки покрываются корками и, как правило, не превращаются в пустулы. Высыпания развиваются приступообразно, так что одновременно видны элементы, находящиеся в разных стадиях развития.

При опоясывающем лишае группы пузырьков расположены на воспаленной коже и локализуются вдоль хода чувствительного нерва. В ряде случаев наступает изъязвление очагов поражений. В редких случаях наряду с типичными очаговыми высыпаниями опоясывающего лишая имеется распространенная везикулезная сыпь, неотличимая от сыпи при ветряной оспе. Опоясывающий лишай, особенно его генерализованная форма, иногда развивается при лимфомах.

Для пузырькового лишая характерно появление одной или нескольких групп пузырьков, расположенных на умеренно воспаленной коже. Высыпания могут локализоваться на всех участках кожного покрова, но чаще всего они располагаются на лице и половых органах.

— Также рекомендуем «Гистопатология оспы. Гистопатология ветряной оспы и опоясывающего лишая»

Оглавление темы «Вирусные болезни кожи»:

1. Споротрихоз. Гистология и диагностика гистоплазмоза

2. Лейшманиоз. Диагностика и гистология лейшманиоза

3. Вирусные поражения кожи. Ветряная оспа — опоясывающий и пузырьковый лишай

4. Гистопатология оспы. Гистопатология ветряной оспы и опоясывающего лишая

5. Морфология оспы. Морфология ветряной оспы и опоясывающего лишая

6. Вакцинная экзема и оспенноподобные высыпания Капози. Заразительный моллюск

7. Бородавка. Строение и гистология обыкновенной бородавки

8. Плоская бородавка. Подошвенная бородавка и остроконечные кондиломы

9. Венерическая лимфогранулема. Узелки доильщиц

10. Липоидозы. Первичный гиперхолестеринемический ксантоматоз

Источник

Методические указания. 1. а) Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову

1. а) Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.

б) Внутриклеточные включения при бешенстве (тельца Бабеша-Негри – выкристаллизовавшиеся нуклеокапсиды вируса) обнаруживаются в нервных клетках аммонова рога и в клетках Пуркинье мозжечка. В препарате, окрашенном по Туревичу, цитоплазма и ядра нервных клеток окрашенны в желто-зеленый (защитный) цвет. Тельца Негри расположены в цитоплазме рядом с ядром клетки и окрашены в ма­линово-красный цвет. При окраске по Манну — тельца Негри красного цвета на голубом фоне цитоплазмы.

Все рассмотренные препараты зарисовать.

   
Вирионы оспы (тельца Пашена)
окраска по Морозову
Тельца Бабеша-Негри при бешенстве
окраска по________________

2. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.

Заражение в мозг (метод применяют при работе с нейротропными вирусами). Для заражения чаще используют белых мышей. Левой рукой плотно прижимают мышь к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы назад. Туберкулиновым шприцем с предохранительной муфтой на игле прокалывают лобную кость несколько латеральнее средней линии и вводят 0,02-0,03 мл материала. Игла вводится на глубину 1,5-2 мм, при этом отчетливо ощущается «провал» в полость черепа.

При заражении новорожденных мышей (2-3-дневного возраста) их лучше брать руками в перчатках, чтобы после заражения мышата не имели постороннего запаха (пота, дезинфицирующих веществ, антибиотиков и т.д.), так как самка съедает мышат, имеющих посторонний запах. Материал вводят в количестве 0,01 мл. Вытекающую жидкость удаляют сухим стерильным ватным тампоном без дезинфицирующих ве­ществ. После заражения мышат помещают в отдельную банку (в свое гнездо), а через 20-30 мин подсаживают к ним самку.

Больных мышат самка также съедает. Поэтому надо уловить момент извлечения зараженных животных для завершения опыта. Первые два дня просматривают мышат 1-2 раза в день, а затем чаще. Через 3-4 дня здоровый мышонок в два раза больше зараженного.

3. Кроме животных для культивирования вирусов используют куриные эмбрионы и культуры клеток различных тканей. Культуры ткани — это клетки ткани выращенные вне организма на специальной питательной. среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки человека и др., а также культуры тканей опухолей (клетки Неla, Нер-2 и др.).

Читайте также:  Схема патогенеза ветряной оспы

Кулътивирование клеток может производиться в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, стенку пробирки.

В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином.

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

Питательной средой для культуры ткани могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие).

Получение первично-трипсинизированных клеток.

Живые клетки для однослойных культур ткани могут быть получены из эмбрионов и органов взрослых животных (напр., из почек) и человека. Для диспергирования ткани используют 0,25-0,3% раствор трипсина, который разрушает межклеточные мостики из соединительной ткани и освобождает клетки.

Метод трипсинизации тканей состоит в следующем: ткань измельчают ножницами (или другим способом) на мелкие кусочки размером 1-3 мм, промывают в буферном растворе Хенкса для удаления крови 2-3 раза, до тех пор, пока жидкость не станет почти прозрачной. Для диспергирования отмытые кусочки ткани обрабатывают раствором трипсина (добавляют 2 объема раствора трипсина) при температуре 32-37°С. Трипсинизацию проводят в течение нескольких минут (до 10 мин) при постоянном перемешивании пипеткой или в смесителе на электромагнитной мешалке. Суспензию клеток собирают в сосуд, помещенный на лед для прекращения действия фермента. К оставшейся ткани добавляют свежие порции трипсина, т.е. процесс повторяют 6-8 раз, иногда и более – до прекращения помутнения раствора трипсина.

Жидкость, содержащую клетки, фильтруют через марлю для отделения от неё комочков ткани и соединительнотканных волокон, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость сливают, а клетки отмывают раствором Хенкса. Отмытые клетки добавляют к питательной среде (гидролизат лактальбумина с сывороткой, или среда 199 , или др.) в разведении 1:200.

4. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа. Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:

Количество клеток в 1 мл = Тельца пашена при оспе ;

где а — количество клеток в камере;

3600 — количество квадратов в камере;

1/4000 мм — объем одного квадрата.

Так как в одном мл 1000 мм , то полученный результат умножают на 1000. После первого разведения (1:200) концентрация клеток дос­тигает 600000-1300000 на 1 мл. Клетки куриных эмбрионов разводят той же средой до концентрации 400000 клеток в 1 мл.

Взвесь клеток разливают по 1 мл в пробирки, которые плотно закрывают стерильными резиновыми пробками для того, чтобы среда не выщелачивалась. Пробирки помещают в термостат при 37°С почти в горизонтальном положении (под углом в 5°) в специальных штативах. Через 3-4 дня при микроскопии виден сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

5. В настоящее время имеется много стабильных штаммов клеток, пассируемых вне организма в течение многих лет. Эти культуры клеток называют перевиваемыми культурами ткани, или растущими культурами ткани. К ним относятся штаммы клеток, полученные из злокачественных опухолей и из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Неla – клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер-2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штамм клеток Детройт-6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) штаммы клеток А-0 и А-1 – клетки амниона человека; 5) штамм клеток ЕRК-клетки почек эмбриона кролика; 6)штамм клеток СОЦ — клетки сердца обезьяны Macacus cyn omolgus и многие другие. Эти штаммы клеток применяются только для диагностики вирусных заболеваний. Они не могут быть использованы для изготовления вакцинных вирусных препаратов, так как культуры клеток, полученные даже из нормальных тканей, в процессе длительных пересевов приобретают характер злокачественного роста.

Посмотреть под микроскопом демонстрационные препараты культур ткани и зарисовать.

   
Фибробласты куриных эмбрионов
окраска по Романовскому
Клетки амниона человека
окраска по Романовскому

6. Для поддержания роста клеток пересев делают через 6-7 дней. Количество клеток за это время увеличивается в 4-10 раз. При пересеве для отслаивания клеток от стекла используют 0,02% раствор Версена (двунатриевая соль этилендиаминотетраацетата – Na2ЭДТА). При добавлении его к культуре клеток он связывает кальций и магний, благодаря которым клетки прикреплены к стеклу, и клетки отслаиваются от стекла.

Читайте также:  Диета при ветряной оспе у взрослых

Предварительно из пробирки или флакона удаляют питательную среду, затем в пробирку вносят 0,5 мл раствора версена, а во флаконы-матрацы объемом 150-200 мл — 10 мл и 25 мл версена соответствен­но. Сосуды помещают в термостат на 20-30 мин, после чего слегка встряхивают. Взвесь вносят в пробирки, центрифугируют при 1000 об/мин 5-10 мин, раствор версена удаляют, а клетки ресуспендируют в питательной среде, Подсчитывают в камере Горяева концентрацию клеток и взвесь разводят до концентрации 200000 клеток в 1 мл. Взвесь вносят по 1-2 мл в пробирки. Пробирки закрывают резиновыми пробками, отмечают карандашом по стеклу лицевую сторону пробирок и помещают их в наклонном положении в термостат.

Подсчитать концентрацию смытых клеток с помощью камеры Горяева и сделать посев культуры клеток в пробирки.

7. Просмотреть монослой выросших клеток и заразить культуру ткани вирусом осповакцины. Техника заражения состоит в следующем. Вирус вакцины разводят синтетической средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой ткани стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят I мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают ее резиновой пробкой и помещают в термостат в горизонтальном штативе.

8. Существует несколько методов заражения куриных эмбрионов: на хорионаллантоисную) оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5-11-дневного возраста. Перед заражением эмбрионы просматривают в темной комнате при помощи овоскопа для проверки их жизнеспособности (живые эмбрионы подвижны с хорошо развитыми сосудами) и определения воздушной камеры и места расположения эмбриона. Место на столе, где производят манипуляции, покрывают салфеткой, смоченной в растворе хлорамина.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Яйцо устанавливают в штативе в вертикальном положении тупым концом вверх. Скорлупу над воздушной камерой обрабаты­вают спиртом, йодом, повторно спиртом, обжигают, прокалывают ножни­цами небольшое отверстие, через которое в полость воздушного мешка вводят одну браншу ножниц и срезают скорлупу над ним. Затем анатомическим пинцетом захватывают в складку и осторожно снимают внутренний листок подскорлуповой оболочки. Под ней находится хорионаллантоисная оболочка, на которую пастеровской пипеткой наносят исследуемый материал в количестве 0,2-0,5 мл. Отверстие скорлупы закрывают стерильным стеклянным колпачком, который закрепляют на яйце расплавленным парафином. Зараженное яйцо помещают в термостат при 37° на 48 часов.

3аражение в аллантоисную полость. После подготовительной работы скорлупу прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца или пастеровской пипеткой на глубину 1-1,5 см материал в объеме 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафи­ном.

Заражение в амниотическую полость. После удаления скорлупы над воздушной камерой бранши пинцета вводят в аллантоисную полость в направлении эмбриона на глубину 2-2,5 см, захватывают амниотическую оболочку, выводят ее из глубины, прокалывают иглой шприца и в амниотическую полость вводят материал в количестве 0,1 мл. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком и парафинируют.

Заражение в желточный мешок (этим методом чаще пользуются для выделения риккетсий). Просмотреть 5-8-дневный эмбрион с помощью овоскопа, отметить границу воздушной камеры и место расположения эмбриона. Исследуемый материал вводят эмбрионам длинной иглой (4-5 см) через небольшое отверстие в скорлупе над воздушной камерой на глубину 2-3 см. При этом надо не повредить зародыш. Во время манипуляции он должен находиться ниже желточного мешка.

Ввести эмбриону на хорионаллантоисную оболочку вирус осповакцины или в аллантоисную полость вирус гриппа.

Контрольные вопросы

Чем отличаются вирусы от всех остальных живых организмов?

Что такое вирион? Что такое капсид, нуклеокапсид, пеплос (суперкапсид)?

Какой тип симметрии может иметь нуклеокапсид?

Какие признаки используются для классификации вирусов?

Почему вирусы считаются облигатными паразитами?

Какие методы используются для культивирования вирусов?

Как заражают новорожденных мышеи?

Что собой представляют тельца Негри и какими методами их окрашивают?

Что такое культура ткани?

Ткани каких органов используются для получения культур клеток?

Как получают культуру первично-трипсинизированной ткани?

Что такое перевиваемые культуры ткани?

Какие Вы знаете штаммы перевиваемых клеток?

Какие среды и солевые растворы применяют для выращивания и для обработки культур ткани?

Как подсчитывают количество клеток и с какой целью?

В каком положении ставят пробирки в термостат и сколько вре­мени выращивают клетки до заражения их вирусом?

По каким признакам судят о размножении клеток?

Как делают пересев клеток для поддержания данного штамма в лабораторных условиях?

Как отбирают пробирки с культурой ткани для заражения вирусом?

Как выглядят растущие клетки?

Как готовят вируссодержащий материал для заражения культуры ткани?

На сколько времени ставят зараженные пробирки в термостат?

Каково строение куриного эмбриона?

Какого возраста эмбрионы используются для заражения?

Как определяет место расположения эмбриона при овоскопии?

Как обрабатывается эмбрион перед заражением?

Какие существуют метода заражения куриного эмбриона?

На сколько времени ставят зараженный эмбрион в термостат для размножения вируса?

Источник