Питательная среда для культивирования коклюша

Среды для выделения, культивирования, идентификации и хранения бордетелл — возбудителей коклюша

а) Картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу). Расчет для приготовления 1 л среды.

Приготовление картофельного отвара: картофель (сорта «Лорх») тщательно моют щеткой с мылом, обтирают спиртом и снимают ножом поверхностный слой, тщательно вырезая все почки. Затем картофель промывают дистиллированной водой, нарезают на куски и отвешивают требуемое количество в чистую посуду. Картофель в количестве 125,0 г заливают 250,0 мл дистиллированной воды, варят до неполной готовности, добавляют 4% глицерина и варят до полной готовности. Отстоявшуюся жидкость фильтруют через 6 слоев марли, предварительно промытой и высушенной. К оставшемуся картофелю добавляют небольшое количество горячей дистиллированной воды, встряхивают, дают немного отстояться и фильтруют через тот же фильтр, после чего доводят объем жидкости до первоначального объема (250,0 мл), добавляя горячую воду (дистиллированную). Стерилизуют при 120°С 15 мин. Картофельный отвар можно готовить впрок.

Приготовление картофельно-глицеринового агара. Вначале готовят солевой агар. К 750,0 мл дистиллированной воды добавляют 0,75% (5,625 г) химически чистого натрия хлорида (NaCl) и 4% (30,0 г) агара. Смесь помещают в автоклав, где агар расплавляют текучим паром в течение 1 ч. После отстаивания (в выключенном автоклаве) агар фильтруют через один слой марли, не выливая осадка в фильтр.

Солевой агар (3 части) и картофельный отвар (1 часть) смешивают в горячем виде, устанавливают pH 7,0-7,2, разливают и однократно стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.

Перед употреблением к растопленному и остуженному до 45°С картофельноглицериновому агару добавляют стерильную дефибринированную кровь в количестве 20-25% (нитратная и консервированная донорская кровь непригодны).

На этой среде колонии возбудителей коклюша мелкие, опалесцирующие с перламутровым блеском, без гемолиза.

б) Основа агара Борде-Жангу, сухая Hi, Bordet Gengou Agar Base. Основа среды Борде-Жангу после обогащения стерильной дефибринированной кровью может быть использована для выделения B.pertussis в диагностике коклюша.

Состав:

Картофельная вытяжка — 125,0 г

Перевар животной ткани пептический — 10,0 г

Хлорид натрия — 5,5 г

Агар — 20,0 г

pH 6,7±0,2

Суспендируют 40,0 г сухой среды в 1 л дистиллированной воды, содержащей 10,0 мл глицерина. Нагревают среду до полного растворения. Стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин. После расплавления среду охлаждают до 45-50″С, добавляют асептически стерильную дефибринированную кровь животных в количестве 15-20% и разливают в чашки. Засеянные чашки для выделения культур инкубируют во влажной камере при 37°С.

Колонии B.pertussis гладкие выпуклые блестящие, окружены слабовыраженной зоной гемолиза.

в) Казеиново-угольный агар (КУА). Состав:

Казеиновый гидролизат — из расчета, чтобы в готовой среде содержалось 1,3-1,5 г/л аминного азота (расчет количества гидролизата приводится ниже) Однозамещенный фосфат калия (КН2PO4) 0,5 г

Хлорид магния (MgCl2*6H2O) — 0,4 г или 2,0 мл 20%-ного раствора

Крахмал: растворимый -1,5 г

Хлорид кальция (CaCl2) — 0,01 г или 1,0 мл 1%-ного раствора

Сернокислое железо (FeSO4*7H2O) — 0,01 г или 1,0 мл 1%-ного раствора

Сернокислая медь (CuSO4 • 5Н2O) — 0,005 г или 1,0 мл 0,5%-ного раствора

Цистин или цистеин L- либо LD-формы — 0,03 г или 2,0 мл 1,5%-ного раствора

Дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт — 100,0 мл

Агар — 22,0 г

Уголь активированный — 3,0 г

Для приготовления казеинового гидролизата рекомендуется использовать казеин кислотный технический первого сорта, ГОСТ №1211-41, и пищевой кислотный ТУ 153-54, активированный древесный уголь — осветляющей марки А, ГОСТ №4453-48 (может быть использован активированный уголь и другой марки), соляную кислоту — химически чистую с удельным весом 1,19.

Казеин отмывают 0,2%-ным раствором уксусной кислоты в течение 6-7 дней (25,0 мл 80%-ной уксусной кислоты на 10 л воды). В первый день раствор меняют 3 раза, а в последующие 5-6 дней — по одному разу в день. Затем казеин промывают дистиллированной водой, хорошо отжимают и высушивают при температуре 60-70°С или при комнатной температуре. Гидролизат казеина получают под давлением при помощи концентрированной соляной кислоты.

Для этого в стеклянной посуде (колба или бутыль емкостью в 2 л) смешивают 400,0 г казеина, 400,0 мл соляной кислоты и 200,0 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют при 127°С в течение 3-4 ч. После автоклавирования гидролизат двукратно разводят дистиллированной водой, фильтруют через полотно или бумагу. Затем объем фильтрата доводят дистиллированной водой до 3 л и осветляют активированным углем. Для этого добавляют 50,0 гугля на 1 л фильтрата.

Смесь кипятят в течение 10 мин и пропускают через бумажный фильтр. Из указанного выше количества казеина получается примерно 3 л гидролизата, который представляет собой прозрачную жидкость слегка желтоватого цвета. После фильтрации в готовом гидролизате определяют количество аминного азота методом формольного титрования.

Гидролизат можно хранить при комнатной температуре при добавлении 0,5% хлороформа в течение нескольких месяцев.

Приготовление диализата дрожжей. Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1,0 кг размешивают в 1л дистиллированной воды до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей водопроводной воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду, в которую предварительно наливают 1,3 л дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в воду. Диализ ведут при температуре 60-80°С в течение 6 ч (за это время количество воды должно уменьшиться примерно в 2 раза). Затем жидкость переливают в стерильную бутыль.

Для повышения выхода диализата можно повторить диализ этих же дрожжей следующим образом: мешок с дрожжами заливают второй раз таким же количеством дистиллированной предварительно нагретой до 70°С воды. Сосуд, в котором проводится диализ, в целях сохранения тепла накрывают ватником и оставляют на ночь. На следующий день жидкость смешивают с первой порцией, добавляя хлороформ, и сохраняют при температуре 5-7°С до 3 мес.

Приготовление экстракта дрожжей. Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1,0 кг суспендируют в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром (100°С) в течение 30 мин, затем отстаивают в холодильнике (+4°С) в течение 5 сут. Надосадочную жидкость декантируют (осторожно сливают), разливают во флаконы и вновь стерилизуют при 100°С в течение 30 мин. Последующее хранение дрожжевого экстракта рекомендуется в холодильнике.

Количество гидролизата казеина, которое берут для приготовления казеиново-угольного агара, не является постоянным, а меняется в зависимости от содержания в гидролизате аминного азота. Количество гидролизата, которое следует взять для приготовления среды, определяют следующим образом: если, например, в исходном казеиновом гидролизате содержится 8,0 г/л аминного азота, а в изготовляемой среде должно содержаться его 1,5 г/л, то производят расчет:

(1000 мл * 1,5 г/л)/8,0 г/л = 187 мл гидролизата на 1 л готовой среды

Приготовление среды. Казеиновый гидролизат и дистиллированную воду (примерно 600,0 мл) смешивают в эмалированной посуде соответствующей емкости и нейтрализуют 20%-ным едким натром (NaOH) до pH-7,0 по бромтимоловому синему (до зеленого цвета). Затем вносят навески различных солей по прописи. Крахмал предварительно растворяют в небольшой порции горячей воды и вносят в виде раствора. Агар промывают под струей водопроводной воды в течение нескольких часов или замачивают на 1-2 ч и вносят в смесь, после чего кипятят 10 мин для расплавления агара над пламенем горелки.

Затем к смеси добавляют цистин или цистеин, дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт. Устанавливают pH 7,3 по компаратору (метанитрофенол) и вносят активированный уголь, тщательно перемешивая. Среду разливают во флаконы или пробирки. Стерилизуют при 110°С в течение 20 мин.

После стерилизации среду во флаконах охлаждают до 45-50°С, тщательно перемешивают для равномерного распределения угля и разливают по чашкам, а среду в пробирках после охлаждения и перемешивания скашивают. Оставшуюся впрок среду во флаконах по мере необходимости растапливают до полного расплавления агара. Излишнее прогревание среды не рекомендуется. Готовая среда должна иметь черный цвет, конденсационная вода не должна содержать частиц угля. Среда, разлитая в чашки Петри, хранится в холодильнике в течение недели.

Для улучшения качества питательной среды одновременно с цистином можно добавить 0,03 г пролина или глутамина на 1 л среды.

Выросшие колонии бордетелл — мелкие, с «хвостиком», опалесцирующие, с перламутровым блеском, без гемолиза.

г) Казеиново-угольный агар КУА (г.Махачкала, НПО «Питательные среды»). Коммерческая сухая питательная среда; готовится согласно инструкции производителя.

53,0 г препарата размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят до полного расплавления агара, стерилизуют автоклавированием при 110°С в течение 30 мин. Для улучшения ростовых качеств среды при варке дополнительно вносят 1,0 г активированного угля. Перед употреблением к растопленному и остуженному до 45°С КУА добавляют стерильную дефибринированную кровь в количестве 10-15% (нитратная и консервированная донорская кровь непригодны).

д) Питательный агар с тирозином для выявления образования пигмента из тирозина. Состав:

Дистиллированная вода — 100,0 мл

Сухой питательный агар — 3,5 г

Тирозин — 0,1 г

Среду расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при 112°С 20-30 мин. Готовая среда имеет бледно-желтый цвет. При положительном результате среда приобретает коричневый цвет.

е) Среда для хранения культур коклюшного микроба в консервирующей смеси (рецепт МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского). Готовят 2 раствора: 1) 80%-ный раствор глицерина в буферном физиологическом растворе; 2) сахарозо-желатиновая среда (смесь, содержащая 10% сахарозы и 1% желатины в воде). Смешивают по 2,0 мл первого и второго растворов в стерильных агглютинационных пробирках, помещают на дно пробирки 3-4 петли 3-суточной коклюшной культуры и хранят в морозильной камере холодильника или в глубокой морозильной камере при -30°С под ватно-марлевой пробкой до 1 года. При необходимости высева берут петлей материал со дна пробирки и высевают на среду КУА с кровью, растирая шпателем.

Приготовление сахарозо-желатиновой среды:

1. На водяной бане при 55°С растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды 10,0 г желатины.

2. Растворяют в 300,0 мл дистиллированной воды 100,0 г сахарозы.

Соединяют оба раствора, доводят дистиллированной водой до 1000,0 мл, устанавливают pH 7,0 раствором бикарбоната натрия (NaHCO3), стерилизуют текучим паром в автоклаве 3 дня по 1 ч. Хранят во флаконах.

80%-ный раствор глицерина в буферном растворе стерилизуют в автоклаве при 107°С (1,3 атм) в течение 30 мин.

ж) Полужидкий казеиново-угольный агар с кровью и без для хранения коклюшных культур (рецепт Центра ГСЭН г.Москвы). Казеиново-угольный агар готовят по прописи, но агара добавляют 1,0 г на 1 л среды (0,1%), разливают по пробиркам (в количестве до 8,0 мл) и стерилизуют при 112°С 20 мин. В полужидкий агар КУА можно добавить стерильную дефибринированную кровь крупного рогатого скота из расчета 0,5-1 мл на 8,0 мл среды.

Культуру коклюшного микроба засевают в среду, выдерживают в термостате 3-4 дня, а затем без пересева сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре в течение 1 мес.

При хранении культуры коклюшного микроба на плотной среде КУА ее пересевают через 10-14 дней.

ж) Приготовление тампонов для взятия материала при подозрении на коклюш (по прописи Е.А, Кузнецова). На один конец металлической (лучше алюминиевой) легко сгибающейся проволоки плотно наматывают слой гигроскопической ваты. Во избежание аспирации ваты длина тампона не менее 4,0-5,0 см. Затем конец проволоки с ватой (1,0-2,0 см) изгибают под углом 110-120°. Другой конец проволоки монтируют в корковую пробку. Изготовленный тампон помещают в пробирку и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 мин или в сушильном шкафу при температуре 140-150°С в течение 1 ч.

Раствор для смачивания тампонов. В конической колбе смешивают 90,0-95,0 мл предварительно приготовленного 1/15М раствора едкого натра (NaOH) (11,876 г на 1 л дистиллированной воды) и 5,0-10,0 мл раствора однозамещенного фосфата калия (KH2PO4) (9,078 г на 1 л дистиллированной воды). К этой смеси добавляют 0,5 г агара. Смесь стерилизуют при 121°С в течение 20 мин. Затем в горячую смесь добавляют 0,2 г активированного угля (навеску угля стерилизуют отдельно в бумажных пакетиках). Смесь готовят впрок, хранят в холодильнике до 2 мес.

Увлажнение тампонов. Стерильные тампоны перед употреблением смачивают в буферной смеси путем двукратного погружения в пробирку с жидкостью. После смачивания тампон погружают в сухую стерильную пробирку, а затем используют для взятия материала. Стерильные смоченные тампоны можно хранить 3 дня в холодильнике.

— Читать далее «Питательные среды, тесты для выделения, культивирования и идентификации бактерий рода Haemophilus»

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 2.3.2020

Источник