Анализа коклюш 1 320

Лабораторная диагностика коклюша и паракоклюша

Комплексное исследование, направленное на диагностику коклюша и паракоклюша, а также на оценку эффективности вакцинации против коклюша.

Синонимы русские

Возбудители коклюша, паракоклюша; комплексное обследование.

Синонимы английские

Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis; comprehensive examination.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь, мазок из носоглотки, мазок из зева (ротоглотки).

Как правильно подготовиться к исследованию?

• За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не жевать жевательную резинку, не курить. За 3-4 часа до взятия мазков из носа не закапывать капли/спреи и не промывать нос. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.

Общая информация об исследовании

Коклюш представляет собой острую антропонозную бактериальную инфекцию. Возбудитель — Bordetella pertussis (палочка Борде — Жонгу), мелкая неподвижная грамотрицательная коккобацилла, строгий аэроб. Инфекция передается воздушно-капельным путём. Источником инфекции является больной человек с любой формой инфекционного процесса.

В течении заболевания выделяют следующие периоды: инкубационный период (длительностью от нескольких дней до двух недель), катаральный (от 5-8 до 11-14 дней), пароксизмальный, или спазматический (2-8 недель), разрешения (2-4 недели) и реконвалесценции (2-6 месяцев). Наиболее характерными для коклюша являются проявления, характеризующие пароксизмальный период заболевания. К ним относятся сухой спастический кашель, цианоз носогубного треугольника, акроцианоз, возможна рвота, лихорадка, слабость, в гемограмме — лейкоцитоз, лимфоцитоз. Следует отметить, что наиболее тяжело заболевание протекает у детей раннего возраста, возможно развитие осложнений со стороны бронхолегочной и нервной систем. У взрослых и лиц после вакцинации коклюш чаще протекает в легкой, атипичной форме, как правило, без осложнений.

Паракоклюш — это острая бактериальная инфекция респираторного тракта, поражающая детей и взрослых. Возбудителем инфекции является аэробная палочка Bordetella parapertussis. Клинические проявления данного заболевания схожи с картиной коклюша, характерна более стертая смена периодов, легкое течение, редкое развитие осложнений, преимущественно у детей.

Диагностика коклюша и паракоклюша основана на клинико-эпидемиологических данных, результатах изменений в клиническом анализе крови и подтверждается лабораторными методами. В клинической лабораторной диагностике данных заболеваний применяют несколько методов: бактериологический метод для выявления роста колоний возбудителей коклюша/паракоклюша; серологический метод, направленный на определение суммарных антител к данным возбудителям; метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — для выявления генетического материала возбудителя коклюша.

Бактериологическое обследование является первым этапом диагностики, но позволяет выявлять возбудителей только на ранних сроках заболевания, в первые 2-3 недели.

Метод ПЦР является высокоэффективным в диагностике коклюша, позволяет выявлять фрагменты ДНК возбудителя B. pertussis в исследуемом биоматериале, обладает высокой диагностической специфичностью, достигающей 100 %. Использование данного метода рекомендовано в первые три недели от начала клинических проявлений заболевания, то есть в катаральный и ранний пароксизмальный период. В более поздние сроки заболевания диагностическая чувствительность метода падает. Следует отметить, что в отличие от других лабораторных методов ПЦР эффективна на фоне лечения антибактериальными препаратами. Также она используется при обследовании детей раннего возраста, в отличие от более старших детей и взрослых, когда возможно возрастание числа ложноположительных результатов. У лиц, вакцинированных против коклюша, положительный результат данного метода может свидетельствовать о транзиторном носительстве патогена, а не об активной форме заболевания.

Серологическое обследование позволяет выявлять в сыворотке крови специфические антитела, направленные к антигенам возбудителей B. pertussis и B. parapertussis. Они могут быть обнаружены с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

При выборе РНГА в качестве диагностического теста при подозрении на коклюш и паракоклюш следует учитывать клинический период заболевания, возраст пациента и наличие предшествующей вакцинации. Для подтверждения диагноза необходимо определение нарастания титра антител в четыре и более раза в парных сыворотках, взятых с интервалом 10-14 дней. Реакцию ставят параллельно с коклюшным и паракоклюшным антигеном. Серологическое обследование рекомендовано применять в период 3-6 недель от начала первых клинических симптомов заболевания, характеризующий пароксизмальный период коклюша. Данный метод не рекомендуется применять детям до 3 месяцев, так как иммунная система новорождённых в это время ещё незрелая и могут быть обнаружены материнские антитела в низких титрах. Также не рекомендуется проводить серологическое исследование лицам в течение 1 года после вакцинации против коклюша вследствие невозможности различить иммунный ответ на вакцинацию или на первичную инфекцию. Титр антител к B. pertussis может быть определен для оценки эффективности прививки против коклюша у детей.

Для чего используется исследование?

• Для комплексной лабораторной диагностики коклюша и паракоклюша.
• Для диагностики коклюша в первые три недели от начала заболевания, характеризующие катаральный и ранний пароксизмальный период, а также на фоне лечения антибактериальными препаратами.
• Для диагностики коклюша и паракоклюша в спазматический (пароксизмальный) период заболевания.
• Для оценки эффективности вакцинации против коклюша.

Когда назначается исследование?

• При клинических проявлениях коклюша/паракоклюша: сухой спастический кашель, сопровождающийся глубоким свистящим вдохом, рвотой, цианозом носогубного треугольника, акроцианоз, лихорадка, слабость, насморк, слезотечение.
• При обследовании лиц, находившихся в тесном контакте с больными коклюшем/паракоклюшем.
• При оценке эффективности вакцинации против коклюша.

Что означают результаты?

Референсные значения

1. anti-Bordetella pertussis

Результат: отрицательный.

Титр: 1:80 — условно-защитный титр у невакцинированных лиц; 1:160 — условно-защитный титр поствакцинального иммунитета.

2. anti-Bordetella parapertussis

Результат: отрицательный.

Титр:

3. Bordetella pertussis, ДНК

Результат: не обнаружено.

Причины положительного результата:

• коклюш;
• паракоклюш;
• транзиторное носительство;
• иммунный ответ после вакцинации.

Причины отрицательного результата:

• отсутствие коклюша/паракоклюша;
• неэффективная вакцинация против коклюша;
• снижение иммунологического ответа после вакцинации;
• ложноотрицательные результаты.

Что может влиять на результат?

• Клинический период заболевания, возраст пациента, наличие предшествующей вакцинации;
• применение антибактериальных препаратов в зависимости от стадии (периода) заболевания и применяемого метода лабораторной диагностики;
• особенности иммунного ответа у новорождённых детей;
• предшествующая вакцинация.



Важные замечания

• При интерпретации результатов обследования необходимо учитывать методы диагностики, возраст пациентов, клиническую стадию (период) заболевания, предшествующую вакцинацию.
• Для комплексной оценки полученных результатов их необходимо сопоставлять с эпидемиологическими, клиническими и другими лабораторными данными.

Также рекомендуется

• Посев на Bordetella pertussis/parapertussis
• Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)

Кто назначает исследование?

Инфекционист, педиатр, пульмонолог, оториноларинголог, терапевт, врач общей практики.

Литература

1. Ghanaie RM, Karimi A, Sadeghi H, Esteghamti A, Falah F, Armin S, Fahimzad A, Shamshiri A, Kahbazi M, Shiva F. Sensitivity and specificity of the World Health Organization pertussis clinical case definition / Int J Infect Dis. 2010 Dec;14(12):e1072-5.
2. Przegl Epidemiol. 2014;68(4):633-6.
3. Piekarska K, Rzeczkowska M, Rastawicki W, Dąbrowska-Iwanicka A, Paradowska-Stankiewicz I.Usefulness of laboratory methods in diagnosis of pertussis in adult with paroxysmal cough / Przegl Epidemiol. 2014;68(4):633-6.
4. Fauci, Braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, Loscalzo Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition, 2009.
5. Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis / Bordetella parapertussis. World Health Organization. Dept. of Immunization, Vaccines and Biologicals. WHO/IVB/04.14, 2004.
6. Инфекции дыхательных путей. Диагностика коклюша и паракоклюша. — Методические рекомендации МР 3.1.2.0072-13.

Источник

МР 3.1.2.0072-13 Диагностика коклюша и паракоклюша

MP 3.1.2.0072-13

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

3.1.2. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Диагностика коклюша и паракоклюша

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина); Федеральным бюджетным учреждением науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера» (Г.Я.Ценева, Н.Н.Курова); Федеральным бюджетным учреждением науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.Б.Яцышина, Т.С.Селезнева, М.Н.Прадед); Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства» (Ю.В.Лобзин, И.В.Бабаченко).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 мая 2013 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

Термины и сокращения

АКДС — адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения

ГОСТ — Государственный стандарт

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА — иммуноферментный анализ

КУА — казеиново-угольный агар

ME — международные единицы

МУ — методические указания

ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция

ПСК — период судорожного кашля

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РА — реакция агглютинации

РИФ — реакция иммунофлуоресценции

РНК — рибонуклеиновая кислота

СанПиН — санитарно-эпидемиологические правила и нормы

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

СП — санитарно-эпидемиологические правила

ФС — фармакопейная статья

цАМФ — циклический аденозинмонофосфат

ELISA — enzyme-ed immunosorbent assay (разновидность ИФА)

FHA — filamentous haemagglutinin (филаментозный гемагглютинин)

NASBA — nucleic acid sequence-based amplification (метод амплификации РНК)

PT — pertussis toxin (коклюшный токсин)

RS-инфекция — инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом

1. Область применения

В методических рекомендациях представлена современная микробиологическая характеристика коклюша в условиях массовой вакцинопрофилактики. В них содержится краткое описание рода Bordetella, включая новые виды, открытые в последнее десятилетие, более детальная характеристика биологических свойств В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica, описание бактериологического метода исследования с использованием приемов, повышающих его информативность, современных методов лабораторной диагностики ПЦР и ИФА. Представлены алгоритмы диагностики коклюша в зависимости от вакцинального статуса, возраста и сроков заболевания пациентов. Цель настоящих методических рекомендаций — унифицировать подходы к лабораторной диагностике коклюшной инфекции.

Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Роспотребнадзора (микробиологов, эпидемиологов), специалистов по клинической лабораторной диагностике, инфекционистов, педиатров, семейных врачей и врачей общей практики.

2. Введение

В довакцинальную эру коклюш занимал второе место среди детских капельных инфекций по уровню заболеваемости и первое по уровню смертности. В настоящее время в мире ежегодно заболевает несколько миллионов человек, умирает около 200 тыс. (в 2008 г. — 16 млн заболевших, 195 тыс. смертей).

Специфическая профилактика коклюша, проводимая в нашей стране с 1959 года, отчетливо повлияла на эпидемический процесс, биологические свойства возбудителя и клинику. Этапы массовой иммунизации характеризовались различным уровнем охвата детей прививками против коклюша и, в соответствии с этим, менялась эпидемиологическая обстановка. Низкий уровень иммунизации в 90-е годы привел к росту заболеваемости коклюшем. Достижение охвата прививками детей первого года жизни (более 95%) в последующие годы и поддержание его на этом уровне обеспечило не только снижение заболеваемости коклюшем, но и с 2001 г. стабилизацию показателей на минимальном уровне (3,2-5,7 на 100 тыс. населения). Особенностью эпидемического процесса коклюша на фоне высокого охвата прививками детей раннего возраста является возникновение периодических подъемов. Это объясняется недостаточной напряженностью и длительностью поствакцинального иммунитета, создаваемого в условиях нередкого нарушения календаря прививок, в частности, несоблюдения сроков вакцинации и интервалов между введениями доз вакцины и проведением ревакцинации, что способствует накоплению значительного числа неиммунных лиц. Увеличение охвата прививками привело в настоящее время к изменению возрастной структуры лиц, заболевших коклюшем. Большинство заболевших составляют школьники 7-14 лет — до 50,0%, дети 3-6 лет — до 25,0%, наименьшую долю — дети в возрасте 1-2 лет — 11,0% и дети до 1 года — 14,0%. В периоды подъема заболеваемости коклюшем интенсивность эпидемического процесса определяется заболеваемостью детей школьного возраста. Темпы роста в этой группе увеличиваются в 2-3 раза. Из числа лиц, заболевших коклюшем, 65% составляют привитые.

Поствакцинальный иммунитет не предохраняет от заболевания. Коклюш в этих случаях протекает в виде легких и стертых форм инфекции, которые диагностируются, в основном, ретроспективно (серологически). После перенесенного заболевания остается более длительный иммунитет.

Истинная заболеваемость коклюшем значительно выше за счет недиагностированной коклюшной инфекции (легких и стертых клинических форм). Трудности клинической диагностики коклюша на ранних стадиях заболевания, отсутствие обследования всех длительно (свыше 7 дней) кашляющих или его проведение на поздних сроках заболевания, а также после продолжительного лечения антибактериальными препаратами приводит к низкому проценту выявляемости возбудителя инфекции. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10-20%. Современные методы исследования позволяют проводить раннюю диагностику заболевания (ПЦР) и существенно облегчают постановку диагноза (ПЦР, ИФА).

Таким образом, коклюш в нашей стране требует пристального внимания со стороны врачей различных специальностей. Своевременная и качественная лабораторная диагностика коклюшной инфекции позволит избежать ошибок в постановке диагноза и будет способствовать эффективной терапии.

3. Характеристика рода Bordetella*, биологические свойства возбудителей коклюша и паракоклюша

________________

* Слово «Bordetella» в наименовании раздела 3 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.

Род Bordetella относится к семейству Alcaligenaceae и включает 9 видов: В. ansorpii, В. avium, В. bronchiseptica, В. hinzii, В. holmesii, В. parapertussis, В. pertussis, В. petrii, В. trematum. Первой (в 1908 г.) была описана В. pertussis, бактерия патогенна для человека и является возбудителем коклюша. В. parapertussis была описана в 1938 г., вызывает у людей паракоклюш (коклюшеподобное заболевание), она также была выделена от овец. В. bronchiseptica была описана в 1911 г., является возбудителем заболеваний дыхательных путей у многих млекопитающих (кашля у собак, атрофического ринита у свиней и др.), но встречается также бессимптомное носительство. У человека редко вызывает заболевание, однако описаны случаи, когда у пожилых людей, заразившихся от домашних животных (кроликов), В. bronchiseptica вызывала длительный кашель. В. avium описана в 1984 г., является возбудителем ринотрахеита у птиц. Описано несколько случаев выделения B. avium от пожилых пациентов с отягощенным анамнезом, с клинической картиной пневмонии. В 1995 г. были описаны сразу два новых вида: В. hinzii и В. holmesii. В. hinzii колонизирует дыхательные пути домашней птицы, была выделена от иммуноскомпрометированных пациентов, описан случай летальной септицемии. В. holmesii выделялась только от людей, обнаруживалась в мокроте, несколько раз в крови, этиологическая роль в развитии инфекций не доказана. В 1996 г. выделена В. trematum, возбудитель вызывает раневые и ушные инфекции. В 2001 г. была описана В. petrii, единственный представитель рода, выделенный из окружающей среды и способный жить в анаэробных условиях. В 2005 г. была выделена В. ansorpii, описано несколько случаев выделения от пациентов с онкологическими заболеваниями (из гнойного содержимого эпидермальной кисты, из крови).

Морфологические и культуральные свойства

Бактерии рода Bordetellae — мелкие (0,2-0,5 мкм0,5-2,0 мкм) грамотрицательные коккобациллы. В мазках — часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах, реже в цепочках, имеют нежную капсулу. Все, за исключением В. petrii, — строгие аэробы. Температура выращивания бордетелл +35-37 °С (оптимально +35 °С). Бордетеллы требовательны к условиям роста: 130-150 мг %аминного азота, кровь, дрожжевой экстракт, никотиновая кислота, аминокислоты (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.); наиболее требователен возбудитель коклюша, он растет только на специальных средах, в то время как остальные представители рода растут на кровяном агаре. Классической средой для первичного выделения В. pertussis является среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), позднее были предложены синтетические и полусинтетические среды, в частности, казеиново-угольный агар (КУА). На указанных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: на среде Борде-Жангу — выпуклые, гладкие, блестящие, серебряного цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза; на КУА — выпуклые, гладкие, серого цвета с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлей. В. parapertussis и В. holmesii за счет образования пигмента вызывают потемнение сред с кровью, образуют бурую подложку.

Таблица 1

Ростовые характеристики основных видов бордетелл

Устойчивость: возбудители коклюша и паракоклюша — облигатные паразиты, нестойкие. Погибают при прогревании до 50 °С за 30 мин, при обработке дезинфицирующими растворами. Во внешней среде не сохраняются. Устойчивы ко многим антибиотикам.

Основные биохимические свойства бордетелл, которые используются в практической работе при изучении выделенных культур, представлены в табл.2.

Таблица 2

Дифференцирующие признаки видов рода Bordetella

В. pertussis наименее активна ферментативно (положительный тест на оксидазу). В. parapertussis вырабатывает ферменты тирозиназу и уреазу и не образует оксидазы. Тирозиназа катализирует продукцию пигментов из тирозина, содержащегося в питательных средах, что вызывает их потемнение. Наиболее активна В. bronchiseptica: вырабатывает уреазу, оксидазу, утилизирует цитраты, восстанавливает нитраты до нитритов.

Антигенное строение и серологическая характеристика

К факторам патогенности В. pertussis в первую очередь относят коклюшный токсин. Это экзотоксин, белок с молекулярной массой 117000 Да, состоящий из двух функциональных частей (А и В) и пяти структурных субъединиц (S1-S5): фрагмент А (соответствует субъединице S1) — обладает ферментативной активностью, ингибирует клеточную аденилатциклазу. Участок В (состоит из субъединиц S2-S5) отвечает за присоединение токсина к рецепторам клеток-мишеней. Токсин обладает высокой иммуногенностью, в инактивированной форме включен в состав всех бесклеточных коклюшных вакцин. Определение антител к коклюшному токсину методом ИФА применяется для диагностики коклюша и контроля эффективности вакцинации.

Филаментозный гемагглютинин — поверхностный белок, участвующий в адгезии, обладает протективными свойствами. Включен в состав бесклеточных коклюшных вакцин. В ряде коммерческих ИФА-тест-систем для диагностики коклюша предлагается определять уровень антител различных классов к антигенному комплексу, в состав которого входят гемагглютинин и коклюшный токсин. В отличие от токсина, гемагглютинин не является строго специфичным для В. pertussis, присутствует также у В. parapertussis, может давать перекрестные реакции с Н. influenzae, С. pneumoniae и рядом других бактерий.

Источник